永生化表皮细胞体外快速扩增的实验研究
提要：目的探泔获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术。
方法：通过真核表达载体，把人端粒酶逆转录 酶基因( m R T ) 转入兔表皮细胞，筛选、挑选阳性克隆在微载体。R C C S内快速扩增永生化表皮细胞。观测 R C C S中微载体。培养永生化表皮细胞的生长情况和检测细胞代谢率，进行抗人角细胞广谱角蛋白( A E 1 /A E 3 ) 免疫组化染色，并与常规培养方法进行比较。
结果：永生化表皮细胞在微载。R C C S中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短( P<0 ． 0 1 ) 。在培养第1 0天，细胞数量可达最初接种的 6 4 倍( P<0 ． 0 1 ) 。
结论：联合应用微载体和 R C C S培养技术，能够在体外快速、大量扩增 永生化表皮细胞。
关键词 ：永生化 ；表皮组织工程；旋转生物反应器；微载体
由于烧伤 、 外伤等原因造成的皮肤缺损患者逐年增加，而受可供移植的皮肤来源和供皮手术造成的痛苦 、后遗症的限制，使这些患者的治疗和康复受到了极 大的影响。组织工程技术的发展给治疗这些疾病带来了巨大的希望，但是如何获得大量的种子细胞( 表皮细 胞) 是制约其迅速发展的瓶颈之一。因为正常表皮细胞在体外培养 3 ～5代即进入老化状态，而且其分裂增殖速度较慢，培养条件严格，很难扩增出大量的细胞来满足皮肤组织工程的需要。端粒酶可以稳定端粒长度，延长细胞寿命。旋转生物反应器( rotary cell cultu resystem，RCCS ) 是一个新型的细胞组织培养系统，具有高密度培养人体细胞 、组织的特性。微载体可以提供较大接触面积，有利于细胞的生长。RCCS和微载体的这些特性，使其在组织工程研究领域具有重要的应用前景。
本研究旨在探讨以微载体为载体， 在RCCS中快速、大量扩增永生化表皮细胞的可能性， 进而为这种技术在皮肤组织工程中的应用奠定一定基础。
1. 材料与方法
1.1 分组和材料
实验分为实验组(微载体 RCCS培养组，n=1 0 ) 和对照组 (普通培养组，n=1 0 ) ；pCI hTE RT载体由军事医学科学院郭希民博士惠赠 ；DMEM、FBS 、胰酶、鼠抗人角细胞广谱角蛋白单克 隆( A E I／A E 3 )抗体、G 4 1 8均为Gibeo公司提供。
1.2 兔表皮细胞的分离、培养
参照[ 1 ] 方法进行。兔( 3周龄， 由军事医学科学院实验动物中心提供) 全麻下去毛，取全厚皮片，去除脂肪组织和部分真皮，剪成宽1～2mm，用无钙镁PBS洗涤2次,表皮面向上浸于0．2 4 U／m l DispaseII 4℃消化过夜；将表皮与真皮撕脱分离,剪成1 m m 3 大小， 0．25 ％胰酶消化30 m i n、过滤、离心，制成单细胞悬液，用含1 0 ％F B S的 D M E M(Gibco ) 培养基稀释(含青霉素、链霉素各1 0 0 U／m 1 ) ，按 2．5×l 0 5 接种( 加50ug／ml的牛垂体提取物,5ng/ml表皮生长因子，Sigma)，3 7℃、5 ％孵箱培养。细胞分裂增殖至 8 0 ％左右汇合时,0.25％的胰酶消化传代。
1.3 h T E R T基 因转染
真核表 达载体 P C I — h T E R T采用脂质体转染法 (效率为23％) ，用G418筛选，挑选阳性单克隆扩增培养，获得稳定表达h T E R T克隆。
1 ． 4 在 R C C S内培养永生化表皮细胞
将适量预处理的Cytodex3微载体 (Phamacia，USA )与永生化表皮细胞悬液充分混匀，加入 到 110m l RCCS (Synthecon，USA)中，并补加DMEM培养基至110ml，调整细胞密度为4.0×105／L 。R C C S容器初始旋转速度为 1 0 r/mi n ,10 h后以3 0 r/ m i n 持续搅拌；同时进行永生化表皮细胞的常规培养,两者均在3 7℃、5％孵箱内培养 ，视培养基颜色及p H值变化决定是否换液及换液量。
1.5 细胞生长曲线测定和形态学观察
在倒置显微镜和扫描 电镜下观察常规培养的永生化表皮细胞的形态和生长状况。微载体培养的第 l 0天取 2 ml 细胞培养样品，P B S 洗涤，4 ％戊二醛固定 0.5 h ，1％锇酸固定 0.5 h,梯度乙醇脱水后，乙酸异戊酯置换4 h ，二氧化碳临界干燥器内干燥,真空喷铂金离子，扫描电子显微镜观察细胞生长状况。用四唑盐( M T r ) 比色法测定两组细胞的生长曲线。细胞倍增时间 ( P D) ： P D=[ 1 o g 2 ／ ( 1 o g N 。 • l o g N 0 ) ] ×t ， 其中 和 分别代表接种 后和培养 t h后的细胞数。
1.6 免疫细胞化学分析
胰酶消化收集微载体培养第 l 0天的永生化表皮细胞并爬片，ABC法免疫组化检测 A E 1 ／A E 3 ( 1:1 5 0 ，G i b c o ) 。细胞爬片4％多聚甲醛固定，P B S漂洗，3％的双氧水孵育， 加一抗 4℃过夜 ，加二抗37℃，3 0 m i n ，PBS漂洗 ，加三抗3 7℃，3 0 m i n 。D A B
显色 用同样方法对培养瓶 内培养的细胞进行鉴定。阳性染色棕黄色。
1.7 细胞代谢率测定
参照试剂盒( S i t D ~ a ) 说明书，分别在永生化表皮细胞培养的第1 、3 、5 、7 、9 、11 天时测定RCCS和培养瓶内培养基中的葡萄糖和乳酸浓度。
1.8转染细胞端粒酶活性检测
使用端粒酶检测试剂盒( Sigma )采用TRAP(PCR-based telomerase repeat amplification p mlocol) 按试剂盒的提供的方法进行检测，试剂盒提供的T S R 8 作为阳性对照。
1 .9 统计学分析
采用 S P S S统计软件进行分析。
2 结果
2 .1永生化表皮细胞在微载体表面贴附生长情况
培养3 0 h ，可见大部分永生化表皮细胞贴附于微载体表面，呈半球形。随后细胞向周围伸展 ，伸出伪足于微载体表面。 微载体培养至第 6天，永生化表皮细胞迅速生长，约第10天，细胞汇合达 9 0 ％。
2 .2细胞形态学观察
倒置显微镜观察显示，永生化表皮细胞呈多角形；扫描电镜观察显示，永生化表皮细胞在微载体表面大量增殖，细胞状态良好，永生化表皮细胞形态大部分为不规则或小梭形。
2.3永生化表皮细胞微载体培养与静态培养生长曲线的测定
常规培养和微载体一R C C S培养的永生化表皮细胞生长曲线均呈倒置的“ S ” 形， 二者的细胞倍增时间分别是35 .1 2 h和 l 9 .6 6 h ，前者是后者的1．7 倍。统计学分析显示， P<0.0 1 ，二者相差有显著性意义。
2 .4 免疫细胞化学分析
收集微载体上培养第 l 0天的永生化表皮细胞进行免疫组化分析显示，这些细胞 A E 1 ／ A F 3免疫组化染色均呈阳性。
2 .5 细胞代谢率的测定
微载体培养期间 ，RCCS内培养液的葡萄糖浓度降低速率为9 .8×1 09 /mmol/d ，培养瓶内培养基葡萄糖浓度降低速率为4.2×10-9/m mol / d 同时 R C C S内乳酸的生成速率为6.6 ×1 0-9/m m o l/d，培养瓶内乳酸的生成速率为5.1×1 0 -9mmo l / d 。
2.6 端粒酶活性检测
端粒酶活性检测显示，转染后的表皮细胞可见相隔6b p的多条电泳带，端粒酶呈阳性表达 ， 而未转染的细胞则为阴性。
3 讨论
皮肤组织工程的种子细胞来源一直是制约其发展的关键问题之一，研究人员从干细胞的诱导分化、异体细胞的基因修饰等方面进行了大量的探索来解决这一难题，但均没有取得满意的结果。近年来，端粒酶因其在抗细胞老化方面的重要性而备受关注，端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，具有逆转录活性 ，不依赖DNA聚合酶，可以与自身携带的 R N A模板合成染色体末端 端粒的重复序列( r I t I 1 A G G G) ， 以维持端粒长度的稳定性。端粒酶通过稳定端粒的长度而增强细胞的分裂增殖能力，进而延长细胞的寿命甚至使细胞获得永生化。 B o d n a r 等对采用转染端粒酶基因而永生化的肾上腺皮质细胞的研究发现，该细胞体外培养时问大大超出正常同种细胞，而且能够维持正常细胞的表型，这种研究的成功为大规模的体外扩增种子细胞提供了可能性。本实验研究也表明， 永生化的表皮细胞传至 1 0 0 代仍然保持旺盛的分裂增殖趋势。虽然转染 h T E R T 能够显著延长细胞寿命， 但有实验证明， 转染 h T E R T 的细胞不具有恶性细胞的特征，在细胞周期中表现出接触抑制，这些细胞注入裸鼠皮下，不能形成肿瘤，说明转染 h T E R T的细胞具有应用的安全性。
虽然永生化可以延缓细胞老化，但是仍然不能很好的解决在短时间内扩增出大量种子细胞的问题。微载体培养技术的发明，为体外大规模培养贴壁细胞成为可能。该培养体系的特点是能够为贴壁细胞培养提供充分的表面积，大大提高细胞的生长密度，从而快速有效大规模扩增细胞。1992年，美国N A S A首次发明 R C C S并将其应用于表皮、心肌 、皮肤及肝脏等组织和器官的组织工程研究， 已经取得明显进展。R C C S具有模拟微重力环境、 高密度和高分化度培育人体组织或器官、 破坏性应力小的优点，使细胞在破坏力最小的条件下得到迅速、大量扩增。而传统的培养瓶培养细胞技术，因为细胞附着在平面载体上， 以单层细胞的方式进行分化、增殖，并且补加的细胞生长因子及营养物质分布不均，从而限制了细胞的增殖速度，难以进行大规模细胞培养。本实验首次结合微载体与 R C C S培养技术进行永生化表皮细胞体外培养，结果表明永生化表皮细胞可在微载体上快速大量增殖，10 d内，永生化表皮细胞扩增量增加到接种时的9 5倍，而常规的静态培养 ，永生化表皮细胞只能增加到15倍 ，前者的扩增量是后者扩增量的6.3倍。上述结果表明在 R C C S和微载体培养体系中永生化表皮细胞具有旺盛的分裂增殖能力。 A E 1 ／ A E 3 检测表明， 在 R C C S和微载体培养体系中永生化表皮细胞不但可以快速、大量扩增，而且可以维持表皮细胞的表型。由于没有抗兔 A E 1 ／ A E 3单克隆抗体， 且抗人 A E 1 ／ A E 3与兔 k e r a t i n o c y t e有交叉反应， 本实验结果显示抗人 A E 1 ／ A E 3可以用于检测。受表皮组织来源和相关法律的限制， 且兔与人类的 k e m t i ． n o c y t e 具有相似的细胞生物学特性， 因此 目前普遍采用兔 k e r a t i n o c y t e 用于皮肤组织工程基础研究。
本实验成功的应用 R C C S与微载体培养技术实现体外大规模扩增永生化表皮细胞。该技术为解决表皮组织工程种子细胞来源提供了一种可能，为促进表皮组织工程产品的临床应用奠定了一定的基础。